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O Laboratório de Micologia

O Laboratório de Micologia pertence à Direção Regional de Agricultura e Desenvolvimento Rural (DRA), à Divisão de Qualidade Agrícola (DQA), da Direção de Serviços de Laboratórios e Investigação Agroalimentar (DSLIA).

A principal competência do Laboratório de Micologia é a identificação de fungos causadores de doenças em diferentes grupos de cultura, nomeadamente endémicas, florestais, fruteiras temperadas, fruteiras tropicais e subtropicais, gramíneas, hortícolas e ornamentais de ar livre e estufa, infestantes e aromáticas, as quais, por vezes, comprometem as produções, quer em termos quantitativos, quer qualitativos.

No campo, o diagnóstico das doenças causadas por fungos fitopatogénicos é efetuado pela observação visual das plantas para detetar sintomas (alterações que ocorrem na planta ou apenas em alguns dos seus órgãos, alterando o seu aspeto normal), e/ou sinais (presença do próprio fungo sobre o órgão lesionado da planta), o que por vezes é difícil, dadas as reduzidas dimensões destes microrganismos, pois estes, numa dada fase da sua evolução, podem manifestar sintomas semelhantes aos ocasionados por outros agentes (bactérias, vírus e nemátodes), condições ambientais adversas ou ainda por excesso de água no solo e má nutrição.

Quando não é possível realizar o diagnóstico no campo, é necessário proceder à colheita de amostras (plantas inteiras ou órgãos das plantas infetadas) para serem analisadas em laboratório.

Com o objetivo de isolar/identificar os fungos, as análises iniciam-se no Laboratório de Micologia com a observação visual dos sintomas do material vegetal doente e à lupa binocular para detetar a presença de sinal de fungos.

Quando os sintomas/sinais observados são dos fungos em suspeita, a identificação está concluída, caso contrário, as amostras são sujeitas a uma seleção/separação por órgão e lavadas em água corrente, para eliminar contaminantes, que podem comprometer as análises (figura 1).

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Figura 1 – Preparação das amostras. À esquerda, observação visual do material doente e, à direita, amostras separadas e lavadas​  

Após a preparação/separação das amostras, estas podem ser submetidas a duas técnicas: a técnica da câmara húmida (incubação do material doente à temperatura ambiente sob condições de humidade, com vista a provocar o aparecimento do sinal dos fungos) e/ou a técnica dos isolamentos em cultura pura (material vegetal em análise é induzido a crescer em meios de cultura, que pode ser realizada a partir do sinal presente no material vegetal ou a partir dos sintomas).

Estas técnicas são realizadas numa câmara de fluxo laminar e em condições de assepsia.

Na técnica da câmara húmida, utilizam-se placas de Petri esterilizadas, onde se coloca uma folha de papel de filtro esterilizada e algodão hidrófilo humedecido com água destilada e esterilizada (para manter as condições de humidade no interior das placas). Sobre estes, uma rede de plástico/metal desinfetada com álcool, para evitar o contacto direto do material vegetal em analise com o papel de filtro e algodão hidrófilo humedecidos, e, por sua vez, sobre esta o material doente.

Por fim, as câmaras húmidas são seladas, identificadas com o número interno no laboratório e data de realização e são colocadas numa bancada do laboratório, fora da luz direta e à temperatura ambiente (figura 2).

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Figura 2 – Técnica da câmara húmida. À esquerda, realização da técnica e, à direita, câmaras húmidas a incubar na bancada do laboratório, à temperatura ambiente  

Relativamente aos isolamentos em cultura pura, estes podem ser realizados a partir do sinal presente no material vegetal ou a partir dos sintomas do material vegetal doente.

 

 

 

 

 

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figura3 cima
Figura 3 – Técnica dos isolamentos em cultura pura.
Em cima, realização da técnica e, em baixo,
isolamentos a incubar na estufa de incubação

O isolamento a partir do sinal, também designado por isolamento direto, baseia-se na transferência direta do micélio ou órgãos de reprodução dos fungos para placas de Petri com meio de cultura, com o auxílio de uma agulha esterilizada ao álcool e à chama e depois de arrefecida.

Os isolamentos a partir dos sintomas são realizados com pequenas porções de tecidos dos órgãos subterrâneos ou aéreos obtidos na seleção/preparação.

Com uma pinça e bisturi, esterilizados ao álcool e à chama e depois de arrefecidos, cortam-se pequenos fragmentos com 1 a 2mm de lado da zona de transição (zona entre o tecido doente e o são). Estes fragmentos são desinfetados em hipoclorito de sódio (lixívia), lavados em água destilada e esterilizada, secos em papel de filtro e transferidos para placas de Petri com diferentes meios de cultura.

Finalmente, os isolamentos são identificados com o número interno no laboratório e a data de realização e colocados numa estufa de incubação à temperatura de 22,5±2,5 ºC (figura 3)

Quer as câmaras húmidas, quer os isolamentos em cultura pura são observados periodicamente, com o objetivo de verificar a ocorrência de crescimento de micélios.

Uma vez estabelecidos à lupa binocular e ao microscópio ótico, identificam-se os fungos ao género ou espécie, com base nas caraterísticas morfológicas e culturais e ainda com o auxílio de bibliografia da especialidade (figura 4). 

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Figura 4 – Identificação dos fungos. À esquerda, observação das câmaras húmidas e isolamentos em cultura pura à lupa binocular e ao microscópio ótico e, à direita, fungo Botrytis cinerea observado ao microscópio
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figura5 cima  
Figura 5 – Análise molecular por PCR.
Em cima, colocação das amostras no gel numa tina
de eletroforese e, em baixo, revelação das bandas
de ADN num transiluminador com UV

Além das técnicas descritas, realizam-se ainda análises moleculares por PCR, método de análise que é utilizado para a deteção de fungos com base na extração de ADN (figura. 5). Este tipo de análise está inserido nos programas de prospeção fitossanitária com financiamento comunitário, para deteção de fungos de quarentena.

Concluídas as análises, elabora-se um boletim com o resultado das análises e este é enviado, via digital, aos clientes que nos solicitaram as amostras.

Para além da realização das análises descritas, o Laboratório de Micologia colabora com outros serviços da DRA e representantes na Região, das empresas detentoras de venda de produtos fitofarmacêutico em Portugal, na elaboração de pedidos de extensão da autorização de colocação no mercado de produtos fitofarmacêuticos para utilizações menores (Art.º 51.º) (usos menores) e com a Universidade da Madeira (UMa) na elaboração de artigos científicos. Colabora ainda em ensaios na área da produção de cogumelos e ministra aulas sobre este tema na Escola Agrícola da Madeira.

Duarte Sardinha
Técnico Responsável pelo Laboratório de Micologia
Divisão de Qualidade Agrícola/DSLIA
Direção Regional de Agricultura e Desenvolvimento Rural

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