Clostridium perfringens

O Clostridium perfringens, anteriormente designado por Clostridium welchii, é uma bactéria pertencente à família Bacillaceae, grande, em forma de bastonete (bacilo) e Gram positiva (cora de violeta escuro) (fig. 1), anaeróbia (não necessita de oxigénio para o seu crescimento), catalase negativa (peróxido de hidrogénio não é decomposto pela ação da enzima catalase), oxidase negativa (ausência de atividade de oxidase no citocromo C da bactéria), imóvel e formadora de esporos.

Os esporos dos Clostridium perfringens são altamente resistentes à radiação, à dessecação e ao calor.

A temperatura de crescimento varia entre os 20ºC - 50ºC (temperatura ótima de 37ºC - 47ºC). Temperaturas de 70ºC a 80ºC podem induzir a germinação dos esporos.

Clostridium perfringens são encontrados no solo, nas fezes, no trato intestinal de animais e humanos e em águas contaminadas com fezes.

Fig. 1 – Bacilos Gram +

Clostridium perfringens tem um elevado potencial patogénico, devido a produzirem várias enzimas e enterotoxinas. A enterotoxina é formada durante o processo de esporulação. Produzem lesões inflamatórias no trato gastrointestinal juntamente com enterotoxemia (caraterizada por infeção causada pelo Clostridium perfringens e que afeta vários tipos de animais domésticos, mas não é conhecida por afetar humanos, chamados também de Clostrídeos enteropatogénicos e produtores de enterotoxemia). Proliferam no trato intestinal produzindo e libertando enterotoxinas que originam tanto efeitos localizados como generalizados. Métodos inapropriados de criação, mudanças repentinas de dieta e influências ambientais locais são fatores que predispõem a proliferação dos Clostrídeos no intestino.

Os Clostridium perfringens, de acordo com as toxinas que produzem, estão definidos em cinco tipos (A, B, C, D e E). O modelo de produção de toxinas varia com cada tipo de Clostridium perfringens e determina a síndrome clínica observada.

Exemplos de doenças associadas aos diferentes tipos de Clostridium perfringens: Tipo A - enterite necrótica em frangos; Tipo B - enterite hemorrágica em bezerros; Tipo C - enterite hemorrágica em suínos recém-nascidos; Tipo D: doença do rim polposo em ovinos; Tipo E: enterite em coelhos.

Fatores alimentares e intestinais predisponentes permitem o crescimento excessivo de Clostridium perfringens em ovinos.

No Laboratório de Bacteriologia Clínica do Laboratório Regional de Veterinária e Segurança Alimentar (LRVSA), da Direção de Serviços dos Laboratórios e Investigação Agroalimentar (DSLIA), foram identificados Clostridium perfringens em diferentes matrizes, ou seja, em diferentes tipos de amostras clínicas (fezes, vísceras) colhidas de animais vivos ou mortos. A colheita e entrega das amostras clínicas são da responsabilidade do cliente.

A identificação de Clostridium perfringerns consistiu numa pesquisa de microrganismos em geral, juntamente com a pesquisa de microrganismos anaeróbios por haver suspeita de Clostridium perfringens. Assim sendo, a amostra foi semeada nos quatro meios base: Columbia agar (adicionado 5% de sangue de carneiro desfibrinado); em MacConkey agar; em Mannitol salt agar ou meio de Chapman e em Nutrient agar e incubada a 37ºC durante 24 a 48 horas, para o caso de existirem crescimento de outros microrganismos Gram positivos ou Gram negativos na amostra (por exemplo, Escherichia coli ou Staphylococcus spp).

Para a pesquisa de microrganismos anaeróbios (como Clostridium perfringens), a amostra foi semeada no Columbia agar (adicionado 5% de sangue de carneiro desfibrinado) e inoculada também num tubo com caldo de enriquecimento (Caldo de Tioglicolato com Resazurina) – meio enriquecido de consistência fluida, com baixo potencial de oxidação/redução, ideal para “recuperar” microrganismos anaeróbios estritos.

Fig. 2 – Crescimento de Clostridium perfringens em meio Columbia agar

Tanto a placa de Columbia agar como o tubo com o Caldo de Tioglicolato com Resazurina inoculados com a amostra são colocados numa jarra de anaerobiose (jarra especialmente concebida para permitir o desenvolvimento e cultivo de microrganismos anaeróbios em atmosfera de CO₂) juntamente com a saqueta de anaerobiose (que contém uma mistura de reagentes que absorvem o oxigénio e geram dióxido de carbono) e com o indicador de anaerobiose (fita de papel de filtro impregnada de azul de metileno que altera para uma cor branca quando a atmosfera do interior da jarra tem as condições adequadas para anaerobiose) e incubadas a 37ºC durante 24 a 48 horas.

Fig. 3 - Crescimento de Clostridium perfringens em meio Columbia agar com hemolise

No Columbia agar, as colónias de Clostridium perfringens são cinzentas com hemólise (β-hemólise – hemólise completa das hemácias, formando uma zona transparente ao redor da colónia) (Fig. 2 e 3).

Fig. 4 - API rapid ID 32A

Para a confirmação final, ou seja, identificação final do Clostridium perfringens, é realizado o API rapid ID 32A (galerias para a rápida identificação de microrganismos anaeróbios estritos). Para isso inoculamos uma suspensão bacteriana nas várias galerias (Fig. 4), incubamos a 37ºC durante aproximadamente 4 horas e fazemos a revelação com reagentes específicos, obtendo assim um perfil numérico (Fig. 5), o qual é introduzido numa base de dados (apiweb), dando assim a identificação precisa.

Fig. 5 - API rapid ID 32A revelado

O API reúne uma elevada qualidade e facilidade de utilização com galerias padronizadas e miniaturizadas de testes bioquímicos para serem usadas com bases de dados de identificação abrangentes, assim sendo, a identificação bacteriana é simples, rápida e fiável. Com o acesso ao apiweb obtemos uma ferramenta de última geração, fiável. É uma forma direta e fácil de obtermos resultados de alta qualidade (Fig. 6).

Fig. 6 – Identificação através do apiweb

Erica Pires – Técnica Superior
Analista do Laboratório Regional de Veterinária e Segurança Alimentar/DSLIA
Direção Regional de Agricultura e Desenvolvimento Rural